Microscopia ottica avanzata

La pagina è divisa in due parti: le piattaforme di imaging, cioè gli strumenti con cui si acquisiscono le immagini, e le applicazioni, cioè le domande biologiche a cui queste piattaforme permettono di rispondere.

Le nostre piattaforme di imaging

Microscopia widefield 
Illumina l'intero campione in un unico scatto. È la forma più semplice di microscopia a fluorescenza ed è anche la più sensibile, ideale per osservazioni rapide su campioni fissati e non.

Microscopia confocale 
Elimina la luce fuori fuoco e permette di ricostruire il campione in tre dimensioni. È oggi la tecnica più utilizzata per studiare la struttura interna di cellule e tessuti, fissati o vivi.

Light-sheet microscopy 
Illumina il campione con un sottile "foglio" di luce, acquisendo immagini molto velocemente e con un danno minimo alle cellule. Ideale per campioni grandi e vivi, come embrioni,  organoidi e sferoidi tumorali, osservati per lungo nel tempo.

TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) 
Illumina solo una sottilissima regione a contatto con il vetrino, per osservare in modo estremamente pulito ciò che avviene a livello della membrana cellulare, come l'adesione o i contatti tra cellule.

Microscopia non lineare 
Microscopia a due fotoni, generazione di seconda armonica. 
Usa luce laser per guardare più in profondità nei tessuti con meno danno alle cellule. La generazione di seconda armonica permette inoltre di vedere strutture come il collagene senza alcun colorante. 

Nanoscopia (super-risoluzione) 
STED. 
Supera il limite fisico di risoluzione della luce visibile, rivelando dettagli fino a dieci volte più piccoli rispetto alla microscopia tradizionale.

Microscopia elettronica correlativa (CLEM) 
Combina la microscopia ottica, che mostra dove si trova e cosa fa una molecola in una cellula viva, con la risoluzione ultrastrutturale della microscopia elettronica.
 

Le applicazioni

Acquisizione su campioni fissati e a mosaico 
Il punto di partenza più semplice: una singola immagine su un campione fissato. Quando l'area da osservare supera il campo visivo del microscopio, l'acquisizione a mosaico unisce automaticamente più campi visivi in un'unica immagine di grande formato.

Time-lapse su cellule vive 
Il passo successivo è seguire un campione vivo nel tempo, per osservare processi come la divisione cellulare, la migrazione o i cambiamenti di forma. Si scattano tante immagini nel tempo, con la piattaforma più adatta (widefield, confocale, light-sheet o altre), seguendo il processo mentre avviene.

Microscopia intravitale 
Permette di osservare direttamente cosa accade in un tessuto o in un tumore all'interno di un organismo vivo, in tempo reale. Si basa soprattutto sulla microscopia a due fotoni, che raggiunge profondità di imaging sufficienti a studiare il comportamento delle cellule tumorali nel loro ambiente naturale, incluse le interazioni con il sistema immunitario o la risposta a un trattamento.

Studio dei movimenti molecolari 
Optogenetica, fotoattivazione, FRAP, FLIP 
Queste metodiche permettono di "evidenziare" con la luce un piccolo gruppo di molecole nella cellula e seguirne il movimento nel tempo: si può accendere, spegnere o spostare selettivamente alcune proteine fluorescenti e osservare quanto velocemente si diffondono o si scambiano con quelle vicine. Si eseguono tipicamente al confocale o in widefield. Un modo per capire come si comportano le proteine coinvolte, ad esempio, nella crescita tumorale o nella risposta a un farmaco.

Interazioni tra proteine 
Colocalizzazione, FRET, imaging del tempo di vita della fluorescenza 
Nella cellula, le proteine spesso lavorano a stretto contatto tra loro. Queste metodiche, applicabili su diverse piattaforme, permettono di verificare se due proteine si trovano davvero nello stesso punto della cellula, o addirittura se sono così vicine da toccarsi: strumenti fondamentali per capire i meccanismi molecolari che possono essere alterati nel cancro.

Danno e riparazione del DNA indotti da laser 
Un raggio laser può essere puntato su una regione precisa del nucleo per creare un piccolo danno controllato al DNA. Osservando cosa succede subito dopo, si vede in diretta quali proteine intervengono per riparare il danno: un aspetto centrale nello studio dei meccanismi che, se alterati, possono favorire lo sviluppo di un tumore.

Meccanobiologia 
Le cellule rispondono anche a stimoli fisici, non solo chimici: quanto è rigido il tessuto intorno a loro, quanta forza ricevono o esercitano. Queste metodiche permettono di misurare e, in alcuni casi, riprodurre queste forze meccaniche, importanti nella crescita e nella diffusione dei tumori.

Microiniezione 
Con strumenti di precisione è possibile iniettare sostanze - DNA, proteine, coloranti - direttamente in una singola cellula vivente, utile per testare l'effetto di una molecola in modo mirato.

Per capire quale piattaforma o metodica sia più adatta al proprio progetto di ricerca, i ricercatori possono contattare l'unità di Microscopia Ottica Avanzata: il nostro team è a disposizione per aiutare a definire l'approccio sperimentale più adatto.